Действие игры одновременно разворачивается в недалёком будущем и в прошлом, во время третьего Крестового похода. В будущем времени героем является Дезмонд Майлс, обычный бармен, который был похищен корпорацией «Абстерго Индастриз», крайне заинтересованной в генах Дезмонда. Очнувшись, герой обнаруживает себя лежащим в странном устройстве в лаборатории. В курс дела его вводят двое ученых: Люси Стиллман и Уоррен Видик. Дело в том, что он является последним из древнего рода убийц, служивших в Братстве ассасинов. В частности, одним из его предков был убийца по имени Альтаир ибн Ла-Ахад, который и является героем действия в прошлом. Люси и Видик, с помощью аппарата «Анимус», декодирует генетическую память Дезмонда, которая, по словам Уоррена, содержит помимо всего прочего, воспоминания о деяниях его предков. Молодому бармену приходится раз за разом переживать приключения своего дальнего родственника.

Альтаир — убийца, один из лучших во всём Братстве Ассасинов. Поэтому ему поручено вместе с двумя напарниками найти гробницу в районе Иерусалима и добыть из неё некий важный артефакт. В этой гробнице Альтаир встречается лицом к лицу с Крестоносцами, которые также разыскивают ценность. Он решает, что это отличный шанс уничтожить Робера IV де Сабле, гроссмейстера Тамплиеров. Проявив самонадеянность, ассасин провалил покушение на жизнь де Сабле и подставил под удар своих напарников. Он ни с чем вернулся в Масиаф, где поведал старцу Аль-Муалиму о своём крахе. К несчастью Альтаира, один из его напарников выжил, потеряв руку и брата, и вернулся в Братство. Более того, он принёс с собой искомую реликвию — «Частицу Эдема». В это время на Масиаф напал Орден Тамплиеров, и хотя Альтаир помог ассассинам отбиться, его обвинили во всех жертвах этого нападения и поступлении тремя основными принципами братства, главный из которых — «Не подставляй под угрозу Братство». Аль-Муалим разыграл казнь Альтаира.

После этого Альтаир пришёл в себя и узнал, что он вовсе не мёртв. Однако он был полностью понижен в ранге и уровень доверия к нему упал. Чтобы восстановить свою репутацию в глазах Братства и обрести «мир в себе», Альтаир должен убить девятерых важных лиц в трёх городах: Дамаске, Акре и Иерусалиме...

Игра продолжается вскоре после событий Assassin's Creed, где в 2012 Дезмонд Майлс — пленник «Абстерго Индастриз», которого используют для дешифрования его генетической памяти о его предке-убийце Альтаире в машине «Анимус». «Абстерго», современный эквивалент рыцарей Тамплиеров, использовали Дезмонда, чтобы определить местонахождение мощного артефакта, именуемого «Частицей Эдема», или «Яблоком». Используя Орлиное зрение, полученного в результате «эффекта просачивания» (из-за частого нахождения в Анимусе), Дезмонд стал видеть сообщения и символы, написанные кровью на его стене спальни предыдущим испытуемым, именуемым «Объект 16». Люси Стиллман, сотрудник Абстерго и член братства современных ассасинов, освобождает Дезмонда и прячет его в секретном укрытии к двум другим ассасинам, Шону Гастингсу и Ребекке Крэйн. С их аналогом «Анимус 2.0», они приглашают Дезмонда помочь им использовать его генетическую память о его предке, Эцио Аудиторе де Фиренце, по двум причинам: тренировать Дезмонда навыкам ассасина с помощью эффекта просачивания, и найти другие Частицы Эдема.

Действие игры разворачивается в Италии, в Эпоху Возрождения, конец XV века. Главным героем игры становится семнадцатилетний юноша по имени Эцио. Отца Эцио, Джованни Аудиторе, предал его лучший друг, и в ходе обвинения, отец и братья Эцио были повешены. Для Эцио это была душевная травма, потерять семью. Он убивает предателя его отца и пытается укрыться вместе с матерью и сестрой у своего дяди Марио, на вилле Аудиторе в Монтериджони.

Позже Эцио узнает, что его семью предала семья Пацци, и он решает расквитаться с ней. Сперва он убивает младшего из этой семьи, Вьери Пацци, затем его отца, Франческо Пацци, а затем старшего из семьи предателей — Якопо Пацци. Так начинается долгая месть за предательство...

40-летний Эцио Аудиторе да Фиренце поднялся на вершины иерархии ордена послеокончания событий игры Assassin's Creed II. Отомстив убийцам отца и братьев, он покинул Рим и наслаждается жизнью в своей вилле. Действие игры начинается в 1499 году, фамильная резиденция рода Аудиторе Монтериджони (англ. Monteriggioni) осаждена наёмниками семьи Борджиа. Осаду проводит сын Родриго Чезаре Борджиа. В осаде, на глазах у Эцио, погибает его родной дядя Марио. После этого действие игры переносится в 1503 год, где Эцио, уже как глава Ордена Ассасинов, пытается найти убийц своих родственников и отомстить им, а также вернуть Риму былой мир, порядок и процветание. В будущем Дезмонд, Люси, Шон и Ребекка прибывают в Монтериджони. Они должны пройти подземные туннели и устроить укрытие в Святилище под виллой Аудиторе для того, чтобы найти Яблоко Эдема и приостановить надвигающуюся катастрофу.